МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
(Минсельхозпрод России)
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ
5.06.98 n13-7-2/1263
ВРЕМЕННОЕ НАСТАВЛЕНИЕ
по применению набора компонентов
для выявления антител к вирусу
инфекционного ларинготрахеита птиц
иммуноферментным анализом
(в порядке широкого производст-
венного испытания в 1998-2000 гг.)
1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
1.1. Набор предназначен для выявления в сыворотке крови кур
специфических антител к вирусу инфекционного ларинготрахеита птиц
(ИЛТ) непрямым методом иммуноферментного анализа (ИФА). Принцип
непрямого метода ИФА заключается в использовании антивидового
иммунопероксидазного конъюгата против igg кур, который
присоединяется к образовавшемуся на поверхности лунок
полистиролового планшета комплексу антиген-антитело и за счет
реакции фермента с субстратом способствует его выявлению.
1.2 . Исследуют сыворотку крови из птицехозяйств , где имеется
подозрение на ИЛТ, или проводится против этого заболевания
вакцинация. Для исследования получают по 20-25 проб сыворотки
крови кур из птичника, объемом 0,3-0,5куб.см каждая. Для диагностики
рекомендуется проводить исследование проб сыворотки крови,
полученных в начале заболевания и через 14 суток от переболевшей
птицы, а для контроля поствакцинальных антител - пробы сыворотки
крови, отобранные на 21 сутки после последней вакцинации.
1.3 . Пробы сыворотки крови сохраняют при 4°С или на льду, не
допуская их оттаивания и повторного замораживания , и исследуют в
возможно короткие сроки. Диагноз на ИЛТ устанавливают комплексно:
на основании эпизоотологических данных, клинических признаков,
патологоанатомических изменений и результатов лабораторных
исследований.
1.4. В состав набора входят иммуноспецифические и
неспецифические компоненты.
Иммуноспецифические компоненты:
Компонент № 1 ( К 1) - положительная сыворотка крови кур к
вирусу ИЛТ (положительный контроль), разведенная 1:40,
лиофилизированная , 1,0 см 3 -1 ампула (флакон).
Компонент №2 (К 2) - отрицательная сыворотка крови кур (отри-
цательный контроль) не содержащая антител к вирусу ИЛТ, разведенная
1:40, лиофилизированная, 1,0 см 3 -1 ампула (флакон).
Компонент №3 (К 3) - очищенный антиген вируса ИЛТ, адсорби-
рованный по 0,1 см 3 в лунках планшета для ИФА -2 планшета.
Компонент № 4 ( К 4) - антивидовой иммунопероксидазный конъюгат
против igg кур (рабочее разведение 1: 21), лиофилизированный, 0,2 или
1,0 куб.см -1 ампула (флакон).
Неспецифические компоненты:
Компонент № 5 - набор солей для приготовления буферного раствора:
хлорид натрия (naci) - 19,3 г - 1 флакон (К 5.1); натрий
фосфорнокислый двузамещенный (na hp0 х 12 Н О) - 3,58 г • 1 фла-
2 4 2
кон (К 5.2); калий фосфорнокислый однозамещенный ( КН РО ) -1,36 г
2 4
-1 флакон (К 5.3). Каждая соль фасуется в отдельный флакон.
Компонент № 6 ( К 6) - детергент твин-20, твин-80 или тритон Х-100 -
1 пробирка для микропроб (флакон).
Компонент № 7 ( К 7 ) - 5-аминосалициловая кислота, порошок, 21 или
40 мг -1 пробирка для микропроб (флакон).
Компонент № 8 ( К 8) - гидроперит, таблетка в упаковке, 1,5 г - 1 шт.
1.5. На ампулы и флаконы с иммуноспецифическими компонентами
должны быть наклеены этикетки с указанием: наименования препарата,
объема в ампуле (флаконе)куб.см, рабочего разведения, номера серии,
номера контроля, срока годности. Флаконы, пробирки для микропроб с
неспецифическими компонентами должны иметь этикетки, на которых
указывают наименование компонента, его количество во флаконе (куб.см,
г или мг).
Каждая коробка с набором должна иметь этикетку с указанием:
наименования предприятия-изготовителя и его товарного знака,
названия набора, номера серии, номера контроля, названия и
количества ампул (флаконов) каждого компонента, входящего в набор,
даты изготовления (месяц, год), срока годности, условий хранения и
обозначения ТУ. В каждую коробку набора должно быть вложено
наставление по его применению.
1.6. Срок годности набора 12 мес со дня изготовления, при условии
хранения в сухом темном месте при температуре (4 - 8) °С .
1.7. Браковка. При отсутствии этикетки, нарушении целостности
ампул ( флаконов, пробирок для микропроб), изменений цвета и
консистенции содержимого, наличии хлопьев и посторонних примесей
при растворении , а также при неполном растворении компоненты
бракуют.
2 . ОБОРУДОВАНИЕ И ПОДГОТОВКА КОМПОНЕНТОВ НАБОРА ДЛЯ
ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Для постановки ИФА используют одно- и восьмиканальные
автоматические пипетки со сменными наконечниками разных объемов,
термостат с температурой нагрева (37,5 +- 0,5)° С , бытовой холодильник,
рН- метр, магнитную мешалку, промывающее устройство ручное или
полуавтоматическое, спектрофотометр с вертикальным лучем и
длиной волны 450 нм.
2.2. Приготовление растворов.
2.2.1. Раствор № 1- 0,01 М фосфатно-буферный раствор рН 7,2-7,А с
детергентом до конечной концентрации 0,05%. Для его приготовления
содержимое флакона с хлоридом натрия (К 5.1) растворяют
дистиллированной водой и доводят объем до 1100 куб.см, получая
раствор хлорида натрия. Затем отдельно, на приготовленном растворе
хлорида натрия, готовят растворы "А" и "Б".
Раствор "А" готовят растворением содержимого флакона с натрием
фосфорнокислым двузамещенным (К 5.2) в растворе хлорида натрия,
доводя объем до 100 куб.см. Раствор "Б" готовят растворением
содержимого флакона с калием фосфорнокислым однозамещенным
(К 5.3) в растворе хлорида натрия, доводя объем до 100 куб.см.
Для приготовления 0.01 М фосфатно-буферного раствора рН 7,2 • 7,4
(ФБР) проводят смешивание растворов "А" и "Б" в мерной колбе на
1000 куб.см в следующих соотношениях: раствор "А" - 85,0куб.см, раствор
"Б" - 28,0 куб.см и доводят объем до 1000 куб.см раствором хлорида натрия.
Измеряют значение рН, которое должно быть в пределах 7,2-7,4. При
необходимости рН доводят 0,1 н растворами naoh или hci.
Приготовленный в колбе ФБР рН 7,2-7,4 нагревают до температуры
(50-60) °С и в нем растворяют содержимое флакона (пробирки для
микропроб) с детергентом (К6), получая 0,01 М фосфатно-буферный
раствор рН 7,2-7,4 с детергентом до конечной концентрации 0,05%.
Данный раствор используется для разведения положительной,
отрицательной, исследуемых проб сыворотки крови, антивидового
конъюгата и межэтапной промывки. Допускается хранение раствора при
температуре (4-8) °С не более 15 суток. Перед использованием раствор
прогревают до комнатной температуры.
2.2.2. Раствор n2. Содержимое ампулы с положительной сыво-
роткой крови кур (К1) растворяют в 1,0 куб.см раствора №1. После
растворения, разведение положительной сыворотки в ампуле составит
1:40. Готовят перед использованием . Допускается хранение в
морозильной камере бытового холодильника до 15 суток.
2.2.3. Раствор №3. Содержимое ампулы с отрицательной сывороткой
крови кур (К2) растворяют в 1,0 куб.см раствора №1. После растворения,
разведение отрицательной сыворотки в ампуле составит 1:40. Готовят
перед использованием. Допускается хранение в морозильной камере
бытового холодильника до 15 суток.
2.2.4. Раствор №4. Содержимое ампулы с антивидовым конъюгатом
(К4) растворяют в 21 см3 раствора №1. Готовят перед использованием.
Допускается хранение в морозильной камере бытового холодильника
до 15 суток.
2.2.5. Раствор № 5. 1 % -ный раствор naoh. Готовят растворением 1 г
гидроокиси натрия в 99 куб.см дистиллированной воды. Хранят при
комнатной температуре (20 °С) не более 15 суток.
2.2.6. Раствор №6. Таблетку гидроперита (К8) растворяют в 45 куб.см
дистиллированной воды. Раствор хранят в защищенном от света месте,
при (4-8) ° С не более 10 суток.
2.2.7. Раствор №7. 5-аминосалициловую кислоту (К7) растворяют в
25 куб.см горячей дистиллированной воды (70+-2)°С при постоянном
перемешивании на магнитной мешалке, охлаждают до комнатной
(20 ° С) температуры и доводят рН до (6,0±0,1) с помощью раствора № 5
Готовят непосредственно перед использованием. Не хранят.
2.2.8. Раствор №8. Субстратно-индикаторная смесь. К 0,1 куб.см
раствора № 6 добавляют 3,3 куб.см холодной (4-8) °С дистиллированной
воды. Затем к 2 куб.см полученного раствора приливают 18 куб.см раствора
№ 7, используют немедленно. Не хранят.
3. ПОСТАНОВКА ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА
До постановки ИФА готовят растворы № 1 по п.2.2.1. и № 5 по п. 2.2.5.
Остальные растворы готовят по ходу проведения ИФА.
3.1. Каждую исследуемую пробу сыворотки крови разводят 1:40. Для
этого, в 0,4 куб.см раствора №1 вносят 10 мкл (0,01куб.см) исследуемой
пробы сыворотки крови и перемешивают. Перед разведением
следующей исследуемой пробы сыворотки, производят замену
наконечника пипетки. Для выявления специфических антител в
раститровке, 1:40 разводят 22 испытуемые пробы сыворотки.
3.2. Готовят растворы №2 по п.2.2.2. и №3 по п.2.2.3.
3.3. Из комплекта набора берут планшеты (К 3) и используют для
постановки ИФА. В три лунки одного планшета вертикального ряда А1,
В1, С1 вносят по 0,1 куб.см раствора №2 (положительный контроль ), а в
три следующие лунки d1, Е1, f1 вносят по 0,1 куб.см раствора №3
(отрицательный контроль). В лунки g1, Н1 вносят по 0,1куб.см раствора
№1 (контроль конъюгата и субстратно-индикаторной смеси).
3.4 . Проводят раститровку положительного контроля и исследуемых
проб сыворотки. Для этого в лунки планшета рядов В2 - 12... Н2 - 12
вносят по 0,1 куб.см раствора №1. Затем в лунку А2 вносят 0,2 куб.см
раствора №2 (положительный контроль), а в лунки горизонтального
ряда a3 - 12 - по 0,2 куб.см подготовленных по п.3.1. исследуемых проб
сыворотки крови и проводят раститровку по вертикальным рядам,
начиная от разведения 1: 40 до 1: 5120. С этой целью, из лунок А2 -12
отбирают по 0,1 куб.см и переносят в лунки В2 -12 соответствующего ряда,
пипетируют и проводят двукратные последовательные разведения
переносом по 0,1 куб.см в очередную лунку вертикального ряда, удаляя из
последних лунок Н2 -12 по 0,1 куб.см. В следующем планшете
аналогично проводят раститровку по вертикальным рядам
инспытуемых проб сыворотки из лунок А1-12 no Н1-12.
3.5 . Выявление специфических антител в сыворотке крови при
контроле поствакцинальных антител можно проводить и без
раститровки испытуемых проб. В этом случае, по п. 3.4. проводят
раститровку только положительного контроля, а в лунки планшета
a3 -12 ... НЗ -12 и во все лунки следующего планшета вносят по 0,1 куб.см
исследуемых проб сыворотки крови в разведении 1:80, используя по
одной лунке на каждую пробу. Для получения разведения 1:80, в 0,8куб. см
раствора № 1 вносят 10 мкл (0,01 куб.см) исследуемой пробы сыворотки.
Перед разведением следующей исследуемой пробы сыворотки,
проводят замену наконечника пипетки. Для выявления специфических
антител в одном разведении, 1:80 разводят 176 испытуемых проб
сыворотки.
3.6. Планшеты осторожно встряхивают для перемешивания
содержимого, закрывают крышками и помещают в термостат
(37,5 ± 0,5) О С на 30 мин.
3.7. Проводят промывку . Для этого, из лунок планшетов энергично
вытряхивают содержимое, прикладывают перевернутый планшет к
фильтровальной бумаге и заполняют все лунки по 0,2 куб.см раствором
№1, следя за тем, чтобы струя раствора попала в каждую лунку.
Содержимое лунок вновь вытряхивают, а остатки раствора удаляют,
постучав несколько раз перевернутым планшетом по фильтровальной
бумаге. Повторяют процедуру промывки 2 раза.
3.8. Готовят раствор №4 (раствор конъюгата) по п.2.2.4. и вносят во
все лунки планшетов по 0,1 куб.см. Планшеты закрывают крышками и
помещают в термостат ( 37,5 +- 0,5)0 С на 30 мин.
3.9. Готовят растворы № 6 по п.2.2.6 и №7 по п.2.2.7.
3.10. Проводят промывку по п.3.7.
3.11. Готовят раствор №8 ( субстратно-индикаторная смесь) по п.2.2.8.
и вносят во все лунки планшетов по 0,1куб.см. Планшеты оставляют при
комнатной температуре, визуально отмечая протекание цветовой
реакции по показаниям положительного и отрицательного контролей.
3.12. При спектрофотометрическом учете реакцию останавливают
внесением во все лунки планшетов по 25 мкл (0,025куб.см) раствора naoh.
4. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ
4.1. Учет результатов ИФА проводят через 25 - 40 мин одним из
способов: визуально - по интенсивности окрашивания содержимого
лунок планшета или инструментально - с помощью спектрофотометра
с вертикальным лучем , при длине волны 450 нм.
4.2. При визуальном способе учета, первоначально проводят оценку
результатов по контрольным лункам планшета: положительный
контроль - содержимое лунок А1, В1, С1 должно иметь коричневое
окрашивание, содержимое лунок ряда А2 - Н2 - от коричневого до
бесцветного или бледно-соломенного окрашивания; отрицательный
контроль - содержимое лунок d1, Е1, f1 , а также контроль раствора
конъюгата и субстратно-индикаторной смеси • содержимое лунок g1, Н1
должно быть бесцветным или иметь бледно-соломенную окраску. Это
дает основание считать , что компоненты набора соответствуют ТУ и
можно приступать к учету реакции с испытуемыми пробами сыворотки.
При визуальном учете реакции , сравнивают окраску содержимого
лунок планшета испытуемых проб сыворотки крови с окраской лунок
контрольных образцов. Раститровка положительного контроля и
испытуемых проб сыворотки крови дает возможность количественно
оценивать титр специфических антител. За титр испытуемой пробы
сыворотки крови принимают её последнее разведение , при котором
еще достаточно четко видна разница цветового окрашивания по
сравнению с отрицательным контролем. Интенсивность цветовой
реакции прямо пропорциональна количеству антител к вирусу
инфекционного ларинготрахеита птиц в исследуемых пробах сыворотки
крови. При оценке результатов без раститровки испытуемых проб
сыворотки крови, интенсивность окрашивания в лунке с исследуемой
пробой сыворотки сравнивают с равным по интенсивности
окрашивания разведением положительного контроля ряда А2-Н2.
Реакцию расценивают по принципу - "Да"(+) - в пробе выявлены -
обнаружены специфические антитела к вирусу ИЛТ (положительная
реакция) или "Нет"(-)-отрицательная реакция -в испытуемой пробе
сыворотки крови отсутствуют специфические антитела .
4.3. Инструментальный фотометрический учет результатов анализа
позволяет количественно оценить титры специфических антител в
исследуемых пробах путем измерения значений оптической плотности
с одновременной записью результатов реакции в каждой лунке
планшета на листе бумаги или специальной бумажной ленте. При
спектрофотометрическом учете , результаты оптической плотности
выражают в оптических единицах (ОЕ). Показания величины оптической
плотности для положительной реакции ИФА должны на 0,10 и более ОЕ
превосходить среднюю величину оптической плотности
отрицательного контроля.
5. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ
Обнаружение специфических антител в титре 1:40 и выше у 50 и более
процентов исследуемой птицы, с учетом эпизоотической ситуации,
наличия характерных для ИЛТ клинических признаков и
патологоанатомических изменений, указывает на контакт с вирусом ИЛТ
и дает основание для постановки диагноза. При обнаружении
специфических антител в титре 1:40 менее, чем у 50 процентов
исследуемой птицы, проводят дополнительные вирусологические
исследования. Вакцинация считается удовлетворительной при
выявлении титра специфических антител 1:80 и выше у 80 и более
процентов обследуемого поголовья.
6. ПРЕДЪЯВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИЙ
6.1. В случае несоответствия компонентов набора требованиям по
активности и специфичности или получении неспецифической
реакции, применение его прекращают и в соответствии с указанием
Главного управления ветеринарии Минсельхоза России от 08.05.92 года
№ 22-7/28 " О порядке предъявления рекламаций на ветпрепараты
отечественного производства и закупаемые по импорту" направляют
рекламацию на предприятие-изготовитель,во Всероссийский
Государственный научно-исследовательский институт контроля,
стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (123022,
Москва , Звенигородское шоссе,5)и ЦНМВЛ. При наличии невскрытых
наборов один набор упаковывают, опечатывают и направляют с нарочным
или почтой во ВГНКИ.
Наставление по применению набора компонентов для выявления антител
к вирусу инфекционного ларинготрахеита птиц иммуноферментным
методом разработано во Всероссийском научно-исследовательском
ветеринарном институте птицеводства.
Одобрено Советом по ветеринарные препаратам 17 декабря
1997 года(протокол n5) 000609-ОП