Наставление
по применению набора сывороток
нативных морганеллезных агглютинирующих серогрупповых
1.Общие положения
2.Подготовка сывороток к работе
3.Методика определения серогрупповой принадлежности культур морганелл в РА
4.Порядок предъявления рекламаций
МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА УТВЕРЖДАЮ
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ Заместитель начальника
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Департамента ветеринарии
(Минсельхозпрод России) В.В.Селиверстов
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ
28.04.97г. № 13-7-2/921
НАСТАВЛЕНИЕ
по применению набора сывороток
нативных морганеллезных агглю-
тинирующих серогрупповых
1.Общие положения
1.1.набор сывороток нативных морганеллезных агглютинирующих серогруп-
повых предназначен для серологической идентификации культур энторо-
бактерий вида morganella morganii, выделенных из патологического ма-
териала, кормов, разных объектов внешней среды.
1.2. Набор содержит сыворотки к 8 серологическим группам морганелл
(01, 016, 026, 029, 033,045, 049, "13"),наиболее часто вызывающим
диарею у молодняка разных видов сельскохозяйственных животных. Сыво-
ротки расфасованы во флаконы. В наборе имеется 8 флаконов - по 1 фла-
кону сыворотки каждой перечисленной серогруппы в объеме по 4 куб.см.
По внешнему виду сыворотки представляют собой прозрачную жидкость
светло-желтого или светло-коричневого цвета с розовым оттенком. До-
пускается выпадение кристаллов борной кислоты.
1.3.На каждом флаконе с сывороткой должна быть этикетка с указанием
на ней: наименования предприятия-изготовителя, наименование сыворот-
ки, ее серогруппы и 0-титра, номера серии, номера контроля, объема
препарата во флаконе, даты изготовления, срока годности, обозначения
ТУ. На коробке с набором сывороток должно быть указано: наименование
предприятия-изготовителя и его товарный знак, наименование набора,
перечень серогрупп сывороток, количество флаконов, объем препарата в
каждом флаконе, дата изготовления набора, срок годности, условия
хранения и обозначения ТУ.
1.4.Наборы нативных морганеллезных агглютинирующих серогрупповых сы-
вороток хранят и транспортируют при температуре 2-10 гр.С. Срок год-
ности сывороток при соблюдении условий транспортирования и хранения 3
года со дня изготовления.
1.5.Вскрытые для работы флаконы с препаратами хранят под резиновыми
пробками в холодильнике (2-4 гр.С) и используют в течении срока год-
ности сывороток при отсутствии в них помутнения, неразбивающихся
хлопьев, плесени.
1.6.Сыворотки во флаконах, имеющих трещины, без этикеток, содержащие
посторонние примеси, неразбивающиеся хлопья, плесень, с истекшим сро-
ком годности для применения ее непригодны.
2.Подготовка сывороток к работе.
2.1.Для постановки пластичной РА сыворотки разводят в стерильном
0,85%-ном растворе хлорида натрия 1:110. Разведенные 1:10 сыворотки
хранят в пробирках под резиновыми пробками при температуре 2-4 гр.С
не более 6 мес.
2.2.Для постановки развернутой пробирочной РА готовят исходные разве-
дения серогрупповых сывороток 1:50 в крболинизированном физиологиче-
ском растворе, содержащего 0,5% фенола, для чего берут стерильный
мерной пипеткой 0,1 куб.см нативной сыворотки и вносят ее в пробирку
с 4,9 куб.см карболинизированного физиологического раствора или 0,5
куб.см разведенной 1:10 сыворотки вливают к 2 куб.см карболинизиро-
ванного физиологического растввор; компоненты тщательно размешивают
путем встряхивания пробирки.
3.Методика определения серогрупповой
принадлежности культур морганелл в РА.
3.1. Серогрупповую принадлежность определяют только у культур бакте-
рий,отнесенных по морфологическим, тинкториальным, культкральным и
ферментативным свойствам к роду mogalla, виду М.morganii. Серологи-
ческой идентификации подлежат культуры морганелл, имеющие s-форму,
образующие на плотных питательных средах (МПА, агаре Плоскирева) мел-
кие или средние по размеру (диаметром 1-3 мм) круглые колонии с ров-
ными краями, гладкой блестящей поверхностью, сероватого цвета с голу-
бым оттенком.
3.2. Вначале культуру исследуют в пластинчатой РА с каждой морганел-
лезной серогрупповой сывороткой, входящей в набор. Для постановки РА
на стекле готовят антиген из испытуемой культуры. С этой целью 18-24-
часовую культуру на скошенном МПА смывают 3-4 куб.см физиологического
раствора, полученную взвесь бактерий переносят в чистую сухую (пред-
варительно маркированную этикеткой) пробирку, затем прогревают ее в
водяной бане (температура воды 100 гр.С) в течении 10-15 мин. Взвесь
убитой культуры морганелл центрифугируют при 3-5 тыс. об/мин. в тече-
нии 20 мин. после чего большую часть надосадочной жидкости удаляют и
утилизируют, а меньшую часть (1-1,5 куб.см) смешивают с осадком ис-
пользуют в качестве антигена для постановки пластинчатой РА.
3.3.На чистую обезжириную стеклянную пластину размером 10 х 12 или 10
х 15 см наносят по 1 капле (0,05 куб.см) морганеллезной агглютинирую-
щей сыворотки каждой серогруппы в разведении 1:10, затем во все капли
сывороток вносят бактериологический петлей антиген, которой хорошо
размешивают в сыворотке. Петлю после соприкосновения с каждой серо-
групповой сывороткой обжигают над пламенем горелки. Пластинчатая РА
протекает при комнатной температуре, результаты реакции учитывают в
течение 3 мин. Положительная реакция характеризуется образованием
мелкозернистого агглютината и полным просветлением жидкости. При от-
рицательной реакции капля жидкости остается мутной и хлопья (крупин-
ки) отсутствуют. Сомнительная реакция проявляется наличием слабой
мутности и образованием незначительного количества хлопьев.
3.4.При наличии положительной реакции на стекле с одной, двумя и бо-
лее серогрупповыми сыворотками ставят развернутую пробирочную РА с
этими сыворотками в разведениях от 1:100 до 0-титров, указанных на
этикетках флаконов с гомологичными сыворотками, и антигеном той же
культуры морганелл.
Для приготовления рабочих разведений сывороток вначале мерной пипет-
кой различают карболинизированный физиологический раствор по 0,5
куб.см в несколько чистых сухих пробирок, установленных в одном ряду
штатива (количество пробирок в ряду зависит от 0-титра сыворотки).В
первую пробирку ряда, имеющую маркировку с указанием серогруппы сыво-
ротки и номера исследуемой культуры морганелл, вносят мерной пипеткой
0,5 куб.см соответствующей разведенной 1:50 сыворотки, размешивают ее
путем встряхивания пробирки или 3-4-кратного пипетирования и получают
разведение сыворотки 16100. Затем из первой пробирки ряда переносят
0,5 куб.см жидкости во вторую пробирку ряда, перемешивают ее содержи-
мое, получая разведение сыворотки 16200. Аналогичным образом получают
последующие разведения сыворотки 1:400, 16800 и т.д. Из последней
пробирки ряда удаляют 0,5 куб.см жидкости.
Использованные ранее в пластинчатой РА антиген разводят физиологиче-
ским раствором до концентрации 1 млрд. микробных клеток/куб.см по
стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича или бактерийному стандар-
ту, после чего во все пробирки ряда с рабочими разведениями сыворот-
ки добавляют мерной пипеткой по 0,5 куб.см антигена. Объем жидкости
во всех пробирках должен быть по 1 куб.см.
Одновременно проводят контроли антигена для исключения спонтанной
агглютинации (к 0,5 куб.см карболинизированного физиологического рас-
твора добавляют 0,5 куб.см антигена) и сывороток для исключения фло-
куляции (1 куб.см сыворотки в разведении 1:100 без антигена).
Пробирки с компонентами реакция и контролями встряхивают и помещают
в термостат на 16-18 ч. при температуре 37-38 гр.С, а затем выдержи-
вают 5-6 ч. при комнатной температуре, после чего учитывают результа-
ты реакции визуально и с помощью агглютиноскопа.
3.5.Положительная реакция характеризуется просветлением жидко-
сти,осадок имеет вид "зонтика" с неровными краями; при встряхивании
пробирки осадок разбивается на хлопья, крупинки. При отрицательной
реакции наблюдается просветление жидкости, осадок имеет вид диска,
который при встряхивании пробирки полностью разбивается, образуя го-
могенную взвесь. В контроле антигена агглютинация должна отсутство-
вать, в контроле сыворотки флокуляции не должна отмечаться.
3.6.При положительной РА в разведении сыворотки не ниже 16400 с оцен-
кой не менее двух крестов культуру морганелл относят к соответствую-
щей серологической группе. Если культура агглютинирует одновременно с
двумя-тремя разными сыворотками, принадлежность ее к той или другой
серогруппе устанавливают по наибольшему титру сыворотки, в котором
проявляется положительная реакция. В случае, когда культура агглюти-
нирует с двумя разными сыворотками в одинаковом титре, серогруппу оп-
ределяют, исходя из активности этих сывороток (например, при 0-титрах
сывороток 1:800 и 1:1600 культуру относят к серогруппе, соответствую-
щей первой сыворотке, которая имеет титр 1:800).
4.Порядок предъявления рекламаций.
В случае обнаружения слабой активности или неспецифичности сыворотки
применение данной серии препарата прекращают и в соответствии указа-
ниям Главного управления ветеринарии Минсельхозпрода РФ от 8 мая 1992
года № 22-7/28 "О порядке предъявления рекламаций на ветпрепараты
отечественного производства и закупаемые по импорту" сообщают об этом
биопредприятию, изготовившему препарат, Всероссийскому государствен-
ному научно-иследовательскому институту контроля, стандартизации и
сертификации ветеринарных препаратов (123022, г.Москва, Звенигород-
ское шоссе,д.5,ВГНКИ) и Центральной научно-производственной ветери-
нарной лаборатории (111622, г.Москва, Оранжерейная ул., 23). Одновре-
менно с этим направляют (при наличии) в ВГНКИ один невскрытый набор
сывороток соответствующих серий, соблюдая режим транспортирования,
указанный в Наставлении по применению препаратов.
С утверждением настоящего Наставления на территории Российской Феде-
рации не действует "Наставление по применению набора сывороток на-
тивных морганеллезных агглютинирующих серогрупповых", утвержденное
ГУВ Минсельхозпрода СССР 12 декабря 1991г.
Наставление разработано Всероссийским научно-исследовательским инсти-
тутом ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (ВНИИВСГЭ).
Рекомендовано к регистрации Советом по ветеринарным препаратам
18.12.96 г. Протокол №6, ПВР 1.06.0297-96.