Наставление
по применению тест-системы ПЦР
для обнаружения вируса
классической чумы свиней
1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
2. ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ СИСТЕМЫ
3. СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ
4. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ АМПЛИФИКАЦИИ
5. ПОРЯДОК ПРЕДЪЯВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИЙ
МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
РОСcИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
(Минсельхозпрод России)
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ УТВЕРЖДАЮ
Заместитель руководителя
Департамента ветеринарии
№ 13-7-2/1478 от 18 января 1999 г. В.В.Селиверстов
НАСТАВЛЕНИЕ
по применению тест-системы ПЦР
для обнаружения вируса
классической чумы свиней
1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
1.1. НАЗНАЧЕНИЕ. Тест-система полимеразной цепной реакции (ПЦР) предназначена для
обнаружения вируса классической чумы свиней (КЧС). С помощью данной тест-системы
вирус КЧС может быть обнаружен в инфицированных культурах клеток и патматериале от
больных и павших животных (кровь, селезенка, сердце, печень). Чувствительность реакции
3
составляет 10 ИД . Тест-система рекомендована для определения вирулентного штамма в
50
крови животных через две недели после вакцинации. Один набор рассчитан на 100 анализов.
1.2. Тест-система для определения РНК вируса КЧС методом полимеразной цепной реакции
представляет : набор для выявления вируса КЧС из 10 компонентов, набор для выделения
РНК из 5 компонентов и набор для проведения электрофореза - из 4 компонентов.
1.2.1. Набор для выявления вируса КЧС (10 компонентов):
1. Термостабильная ДНК-полимераза ( taq-полимераза): 50 мкл раствора ДНК-
полимеразы (5000 ед/кл) - 1 пробирка.
2. Мезофильная ревертаза (amv-rt или m-mlv): 50 мкл раствора (10 ООО ед/мл) - 1
проб.
3. Смесь нуклеозидтрифосфатов (dntps): 0,75 мл водного раствора
нуклеозидтрифосфатов с концентрацией 2.5 мМ каждого - 1 проб.
4. Контрольная лиофилизированная вакцина штамма ЛК-ВНИИВВиМ - 4амп 1 куб.см
вещества.
5. Смесь праймеров №1 1: 0,2 мл водного раствора олигонуклеотида №1 с
концентрацией 10 пмоль/мкл - 1 проб.
6. Смесь праймеров №2 : 0,2 мл водного раствора олигонуклеотида №2 с
концентрацией 10 пмоль/мкл - 1 проб.
7. 10-кратный реакционный буфер (10 * буфер): 0,8 мл - 1 проб.
8. 5-кратный реакционный буфер (5 * буфер): 0,5 мл - 1 проб.
9. Деионизованная вода: 5 мл воды, деионизованной системой milli q фирмы millipore
или обработанной диэтилпирокарбонатом - 5 фл.
10. Вазелиновое масло: 8 мл - 1фл.
i.2. Набор для выделения РНК ( 5 компонентов)
ii. Раствор №1: 110 мл - 1 фл.
12. Раствор №2: 40 мл - 1 фл.
13. Раствор №3: 40 мл - 1 фл.
14. Раствор №4: 20 мл - 1фл.
15. Сорбент :4 мл водной суспензии сорбента - 1 пробирка.
1. 3. Набор для проведения электрофореза ( 4 компонента)
( на 10 гелей по 10 образцов).
16. Агароза - 10г- 1 проборка.
17. 10 * ТАЕ буфер : 100 мл раствора - 1 проб.
18. Раствор бромистого этидия 10 мг/мл: 300 мкл раствора - 1 проб.
19.Буфер для нанесения образца: 0,3 мл раствора - 1 проб.
В каждый пакет с тест-системой вкладывается наставление по применению.
1.4. Флаконы и пробирки с компонентами укладывают в коробки с наименованием тест-системы.
На пробирках и флаконах с каждым компонентом должна быть этикетка с указанием краткого
названия и номера компонента.
1.5. На каждую коробку набора наклеивают этикетку с указанием: предприятия-изготовителя и
товарного знака, наименования тест-системы и каждого набора, номера серии и контроля, даты
изготовления, срока годности, условий хранения, обозначения номера ТУ.
1.6. Хранение набора для выявления вируса КЧС - при температуре минус 20 гр.С (не ниже), не
допуская замораживания фермента, хранение наборов для выделения РНК и проведения
электрофореза - при температуре 4 гр.С Срок годности тест-системы - 6 мес.
2. ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ СИСТЕМЫ
2.1. В основе метода лежит многократное повторение циклов денатурации ДНК в исследуемой
пробе при температуре 94 гр.С, гибридизации (отжига) с исследуемой ДНК специфических
олигонуклеотидных затравок (праймеров) при температуре ЬО^С и синтез с них комплементарных
цепей ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы при температуре 72°С.
В результате проведения 36 циклов амплификации, концентрация синтезированного
фрагмента в исследуемой пробе увеличивается в миллиарды раз, что позволяет учитывать
результаты анализа с помощью электрофореза в агарозном геле.
3. СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ
3.1 Выделение вирусной РНК:
Все манипуляции, связанные с использопанием тест-системы ПЦР, проводятся
пипеточными дозаторами типа "Ленпппет" следующих объемов: 0-20 мкл, 20-200 мкл, 0-1000
мкл с использованием полипропиленовых пробирок на 1,5 мл (ПО "Ленполимер") и 0,5 мл
наконечников к пнпеточным дозаторам одноразового использования.
Для выделения вирусной РНК необходимо использовать набор для выделения РНК.
Образцы исследуемого биологического материала (кровь, гомогенат ткани) в объеме 0,2-0,3
мл помещают в полипропиленовые пробирки и добавляют 1,1 мл раствора №1. Инкубируют 10
мин. при комнатном температуре при перемешивании. Пробы центрифугируют на центрифуге
типа "Эппендорф" 5 мин при 13000 об/мин, супернатант переносят в чистые пробирки, а осадок
отбрасывают. К супернатану добавляют 40 мкл сорбента и инкубируют при комнатной
температуре в течение 10 мин, 1-2 раза перемешивая на вортексе. Затем центрифугируют 15 с на
микроцентрифуге при 13000 об./мин, супернатант отбрасывают. К осадку добавляют 0,2 мл
раствора № 2, перемешивают на вортексе и осаждают сорбент центрифугированием в течение 15
с. Супернатант отбрасывают. Процедуру промывки осадка раствором № 2 повторяют. Дважды
промывают осадок сорбента, используя 0,2 мл раствора №3 и один раз, используя 0,2 мл раствора
№ 4. Пробы сушат в течение 10-15 мин при 56гр.С. оставляя пробирки открытыми. К пробам
добавляют по 30 мкл деионнзованной воды,перемешивают на вортексе и инкубируют в течение
10-15 мин при 56°С, в закрытых пробирках. Пробы центрифугируют 1 мин. при 13000 об./мин.
и водную фазу используют для проведения ПНР.
ВНИМАНИЕ: На всех стадиях обработки биоматериала, удаление супернатанта производить
одноразовыми пластиковыми наконечниками при помощи водоструйного насоса в колбу-
ловушку, содержащую дезинфицирующий раствор (3% хлорамин или 5% перекись водорода и т. п.)
3.2. Построение первой цепи кДНК (реакция обратной транскрипции).
В пробирку на 0,5 мкл добавляют 5 мкл раствора № 8, 2,5 мкл раствора №3, по 2 мкл растворов
№5 и №6, 0,5 мкл раствора № 2,10 мкл выделенной РНК и раствор №9 до конечного объема 25
мкл. Инкубируют при 37°С в течение 60 мин. Реакцию останавливают инкубацией 10-15 мин при
-70°С. ( либо 5 мин при 95°С). Для последующей ПЦР используют 5 мкл полученного раствора
ДНК.
3.3. Проведение первого раунда полимеразной цепной реакции.
Идентификация вируса КЧС проводится с использованием полимеразной цепной реакции
(ПЦР) после получения из вирусной РНК фрагментов кДНК. В основе метода лежит
многократное повторение циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе при температуре 94°С,
гибридизации (отжига) с исследуемой ДНК специфических олигонуклеотидных затравок
(праймеров) при температуре 60°С и синтез с них комплементарных цепей ДНК с помощью
термостабильной ДНК-полимеразы при температуре 72°С.
В результате проведения 36 циклов амплификации, концентрация синтезированного фрагмента
в исследуемой пробе увеличивается в миллиарды раз, что позволяет учитывать результаты
анализа с помощью электрофореза в агарозном геле.
В пробирку, объёмом 1,5 мл вносят следующие компоненты набора для выявления вируса КЧС :
10 * буфер - 4 мкл
dntps - 2,5 мкл
смесь праймеров №1 - 1 мкл
ДНК-полимераза - 0,25 мкл
деионизованная вода - до 25 мкл
кДНК - 5 мкл
Перемешивают, все капли собирают центрифугированием в течение 5-10 сек.
На поверхность водной фазы осторожно наносят 40 мкл ( 2-3 капли ) вазелинового масла.
Пробы амплифицируют на амплификаторе .
Температурный режим :
94°С - 2 мин
60°С - 1 мин 1 цикл
72°С - 2 мин
94°С - 0.5 мин
60°С - 0.5 мин 23 цикла
72°С - 0.5 мин
94°С - 2 мин
60°С - 1 мин 1цикл
72°С - 5 мин
3.4 Проведение второго раунда полимеразной цепной реакции
Все процедуры проводят так же как описано в п. 2.3 со следующими изменениями:
- используют смесь праймеров №2
- вместо кДНК используют продукт реакции ПЦР первого раунда-также 5 мкл.
3.5. Контроли - положительный и отрицательный:
В каждой серии анализов ставят два контрольных образца: k+ (положительный) - РНК,
полученная из вакцины, входящей в состав тест-системы, по стандартной методике
выделения и К- (отрицательный) - деионизованная вода (раствор 11). Смеси для
контрольных образцов готовят по той же прописи, что и для исследуемого образца.
При отсутствии расчетного фрагмента (307 п. н.) отобрать 5 мкл реакционной смеси и
поставить повторную амплификацию (реамплификацию) с праймерами №2 и №3 ( растворы
6 и 7). Состав реакционной смеси и режим амплификации вышеописанные. Соотношение
циклов амплификации и реамплификации 25:25.
При точном соблюдении наставления по применению анализ занимает от 8 до 24 ч ( в
зависимости от условий выделения).
4 . УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ АМПЛИФИКАЦИИ
Результаты исследования учитываются путем анализа продуктов амплификации
исследуемых образцов методом электрофореза в агарозном геле.
4. 1. Приготовление буфера для электрофореза.
Для приготовления 1 л буфера для электрофореза навеску 4.04 г Триса растворяют в
200 мл дистиллированной воды, добавляют 1,14 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл 0.5 М
раствора ЭДТА рН 8.0 и доводят объём буфера до 1000 мл дистиллированной водой. В
случае использования набора для проведения электрофореза к 100 мл 10 * ТАЕ буфера
добавить 900 мл дистиллированной воды и бромистого этидия до концентрации 0.5 мкг/мл.
4. 2. Приготовление агарозного геля.
К 2% суспензии агарозы в буфере для электрофореза добавляют бромистый этидий до
концентрации 0.5 мкг/ мл, доводят до кипения и охлаждают до 45°С. Заливают в
специальную форму с гребёнкой и дают затвердеть. Гребёнку осторожно вынимают и форму
с агарозой переносят в аппарат для горизонтального электрофореза (ПГ-9 "Диа - М") и
погружают в буфер.
4. 3. Электрофорез продуктов амплификации.
В пробирки с исследуемыми образцами после завершения амплификации вносят
аккуратно под масло 3 мкл раствора 24 ( 0.25% раствор бромфенолового синего в 50%
глицерине), перемешивают наконечником для пипеточных дозаторов и 10 мкл полученного
образца вносят в лунки агарозного геля, образовавшиеся от зубцов гребёнки.
Электрофорез проводят при напряжении 8 вольт/ см длины геля в течение 60 мин. За
это время краситель успевает пройти не менее половины геля.
4. 4. Учет результатов электрофореза.
Результаты электрофореза учитывают в ультрафиолетовом свете с длинной волны 254
нм на приборе "Трансиллюминатор", предварительно агарозный гель выдерживают в
растворе бромистого этидия ( 0.05 мкг/мл) в течение 20 мин для окрашивания ДНК в геле.
После окрашивания результаты реакции выявляются в виде светящихся красноватых
полос. Положительными ( т. е. содержащими вирус КЧС ) считаются пробы, в которых
полосы в геле располагаются точно на таком же расстоянии от старта, что и полоса
положительного контроля. В отрицательном контроле не должно выявляться никаких
полос.
Исследуемые пробы считаются отрицательными, если в них не выявлено никаких
полос или они не соответствуют по размеру фрагменту в контрольной пробе.
Документирование полученных результатов проводят на фотопленке (Микрат - 300)
аппаратом типа "Зенит" с оранжевым светофильтром.
4.5. Необходимые условия успешного проведения анализа.
4.5. 1. Строгое соблюдение условий хранения компонентов тест-системы.
4.5.2. Разовое (однократное ) использование наконечников и пробирок. Ранее
использованные и мытые наконечники и пробирки использовать нельзя!
4.5.3. При составлении смеси для амплификации вначале готовить отрицательный
контроль, а последним - положительный контроль.
4.5.4. Посуда для отбора образцов биоматериала должна быть одноразовой или
тщательно обработана хромпиком и отмыта.
5. ПОРЯДОК ПРЕДЪЯВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИЙ
Рекламации на качество данной тест-системы в соответствии с указанием Главного
управления ветеринарии № 22-7/28 от 8 мая 1992 г. «О порядке предъявления рекламаций на
ветпрепараты отечественного производства и закупаемые по импорту» направляют предприятию-
изготовителю (123098 Москва, ул. Гамалеи, 16, НПО НАРВАК), во Всероссийский
государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации
ветеринарных препаратов (ВГНКИ) по адресу: 123022 Москва, Звенигородское ш., 5 и ЦНМВЛ
(Москва, Косино, Оранжерейная, 23). При наличии невскрытых наборов данной серии один набор
направляют в ВГНКИ.
Наставление разработано НПО НАРВАК, одобрено Советом по ветеринарным препаратам
Департамента ветеринарии Минсельхозпрода РФ 18.06.1998 г., протокол № 3, № ПВРт1.03.0754-
98.
Начальник отдела ветеринарно-санитарной
экспертизы и лабораторной работы В.И.Белоусов